PCR’da Sıcaklık Döngüleri ve Enzim Tercihi: Taq Polimerazın Rolü.

Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Temel Mantığı

Polimeraz zincirleme tepkimesi (PCR), DNA içerisinde dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. Metot, tüp içerisinde nukleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır ve bir çeşit “in vitro klonlama” olarak da tanımlanır.

Yöntem, belirli sayıda döngünün tekrarlanmasına dayanır. Yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma labuvatuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda kullanılmaktadır.

Döngü İçindeki Sıcaklık Aşamaları

PCR yöntemi genellikle yaklaşık 30 denatürasyon-tavlama-uzama döngüsünden oluşur. Döngülerden önce yaklaşık 5 mnt membacalık bir denatürasyon süreci ve sonrasında yine yaklaşık 5 mnt membacalık bir uzama süreci içerir. Bu ek süreçler, DNA zincirlerinin birbirinden ayrılmış olması ve zincirlerin tamamlandığından emin olunması için gerekli hazırlığı sağlar.

Döngü içindeki aşamalar, kullanılan başlatıcı diziye bağlı olarak değişen sıcaklık aralıklarında gerçekleştirilir. Denatürasyon 94 °C-98 °C aralığında, tavlama ise 55 °C-72 °C aralığında gerçekleşir. Uzama aşamasında ise sıcaklığa dirençli bir DNA polimeraz olan Taq polimeraz kullanılır.

Denatürasyon ve Enzim Dayanıklılığı

DNA dizisinin çoğaltılması için iki zincirin ayırılması gerekir ve bunun için dizinin yaklaşık 20-30 saniye boyunca yaklaşık 95 °C sıcaklıklarına maruz bırakılması gerekmektedir. Çoğu enzim bu sıcaklıklarda denatürasyona uğrayacağı için kullanılamaz. PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı, kullanılan yüksek sıcaklıklara dayanabilen Taq polimeraz enziminin bulunması yapmıştır. Bu enzim ilk olarak Yellowstone Millî Parkı’nda bir kaplıcada yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilmiştir.

Tavlama Sıcaklığının Belirlenmesi

Tavlama sıcaklığı genellikle başlatıcı dizilerin erime sıcaklığının altında olacak şekilde ayarlanır. Erime sıcaklığı, DNA zincirinden ayrıldığı sıcaklık olarak tanımlanır (Tm). Amaç, başlatıcı dizinin özel olarak hedef DNA zincirine bağlanıp diğerlerine bağlanmamasını sağlamaktır.

Bu sıcaklık, guanin ile sitozinin üçlü hidrojen bağı kurup adenin ile timinin ikili hidrojen bağı kurması nedeniyle başlatıcı dizideki AT/GC yüzdesine bağlıdır. Kısa diziler için Tm=2(A+T)+4(G+C) olarak hesaplanabilirken, 13 nukleotitten uzun başlatıcı diziler için Tm=64,9+41(G+C-16,4)/(toplam nukleotit sayısı) olarak hesaplanabilir. Tavlama aşaması yaklaşık 20-60 saniye sürer.

Uzama Aşaması ve Taq Polimeraz

Uzama için Taq polimeraz enziminin en iyi çalıştığı sıcaklık olan 72 °C kullanılır. Uzama süresi, çoğaltılacak olan DNA zincirinin uzunluğuyla doğru orantılıdır ve baz çifti başına 10 saniye ile 1 mnt membacaarasında değişir.

Başlatıcı Diziler ve Yöntem Çeşitleri

PCR yöntemine dayalı olarak primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA dizileri geliştirilmiştir. Bu başlatıcı DNA’lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. Günümüzde başlatıcı diziler çoğaltılacak olan DNA dizisi için özellikle tasarlanır. PCR’a dayalı ARMS, RAPD, AFLP, SSR ve ISSR gibi çeşitli moleküler teknikler geliştirilmiştir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde tür içi ve türler arasında kullanılmaktadır.

PCR’ın çeşitleri arasında DNA yerine mRNA dizisinin çoğaltılmasını sağlayan ters transkriptaz PCR (RT-PCR), DNA’nın varlığını değil miktarını da bulmayı amaçlayan nicel PCR (qPCR) ve birden fazla başlatıcı dizi çifti kullanılarak birden fazla dizi çoğaltılan multipleks PCR yer alır.

Bu açıklama Vikipedi kaynaklarından uyarlanmıştır ve şu lisans altında sunulur: CC BY-SA 4.0.